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技術文章

AAV的定義、方法及應用

點擊次數(shù):47   發(fā)布時間:2024/10/29 10:21:44

一、AAV的定義

AAV是一種單鏈DNA缺陷型病毒,屬于微小病毒科。其基因組DNA小于5kb,無包膜,外形為裸露的二十面體顆粒。AAV不能獨立復制,只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒等)存在時,才能進行復制和溶細胞性感染。AAV的基因組兩端為末端反向重復序列(ITR),中間基因組編碼兩個主要蛋白:Cap(衣殼蛋白)和Rep(復制白)。ITR對于病毒的復制和包裝具有決定性作用。


二、AAV的生產(chǎn)方法

AAV的生產(chǎn)工藝通常涉及多個步驟,包括質粒構建、細胞培養(yǎng)、病毒包裝、收集和純化等。以下是AAV生產(chǎn)的一般流程圖:

質粒構建:設計并合成包含目的基因的載體質粒(Transfer plasmid),同時準備包裝質粒(Packaging plasmid)和包膜質粒(Envelope plasmid)。


細胞培養(yǎng):選擇適合的細胞系(如HEK293T細胞)進行培養(yǎng),并在無菌條件下添加適當?shù)目股匾苑乐辜毦廴尽?/span>


轉染:將三種質粒共轉染到細胞中,常用轉染試劑包括PEI、脂質體等,以提高轉染效率。


病毒包裝:轉染后,細胞內開始產(chǎn)生AAV顆粒,經(jīng)過一定時間(通常48-72小時),病毒顆粒釋放到培養(yǎng)基中。


病毒收集與純化:從培養(yǎng)基中收集病毒顆粒,通過離心或過濾去除細胞殘骸。使用超速離心、親和層析等方法對病毒顆粒進行純化,以提高病毒的純度和滴度。


滴度測定:使用qPCR、ELISA等方法測定AAV的滴度,評估病毒的感染能力。


儲存:將純化后的AAV顆粒分裝并儲存于適當條件下(通常是-80°C),以備后續(xù)實驗或臨床應用。

三、AAV的應用


基因治療:AAV作為基因治療載體,廣泛應用于多種遺傳性疾病的治療。例如,F(xiàn)DA已批準使用AAV2載體治療RPE65相關視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(LUXTURNA)和使用AAV9載體治療脊髓性肌肉萎縮癥(ZOLGENSMA)。AAV載體能夠高效地將治療性基因傳遞到患者細胞中,實現(xiàn)長-期穩(wěn)定的基因表達。


基因傳遞與功能研究:AAV可用于將外源基因引入體外培養(yǎng)的細胞中,用于研究基因功能、基因調控等問題。這種技術在科學研究中是一種常見的工具,有助于深入了解基因與疾病之間的關系。


免疫治療:AAV還可用于免疫治療,通過引入特定的免疫基因來增強機體的免疫力,對抗某些類型的癌癥或感染。例如,AAV載體可以攜帶免疫刺激分子或腫瘤相關抗原的基因,誘導機體產(chǎn)生特異性免疫反應。


基因編輯:AAV病毒還可以作為基因編輯工具的運載體,如將CRISPR-Cas9系統(tǒng)引入細胞中,實現(xiàn)對基因組的精確編輯。這種技術在遺傳性疾病治療、癌癥治療等領域具有廣闊的應用前景。


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